本发明公开了一种用于PCR步移技术的半随机引物、试剂盒及运用所述试剂盒进行PCR步移的方法。所述半随机引物的序列如序列表中SEQSEQ ID NO.5所示。所述试剂盒包括所述半随机引物。所述方法同普通二条引物的PCR相类似，最多只需二轮PCR即可获得目标序列，操作简单、快速、高效。该方法通过提高了整个PCR循环过程中的退火温度，增加了扩增特异性，且对实验材料没有限制，微生物、动物和植物样品均可使用。本方法用于实验中可以简化操作，缩短实验时间，提高实验效率，降低实验成本，具有十分广阔的应用前景。
1.一用于PCR步移技术的半随机引物，其特征在于，其序列如SEQxa0IDxa0NO.5所示。
2.一种用于PCR步移技术的试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1所述的半随机引物。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括dNTP、PCRxa0buffer、Mg²⁺、Taqxa0DNA聚合酶和ddxa0H₂O中的任一种或多种。
4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括基因组DNA抽提试剂。
5.一种以如权利要求2～4任一项所述试剂盒进行PCR步移的方法，其特征在于，其包括如下步骤：以与待测DNA已知序列相互补的上游引物1和如权利要求1所述的半随机引物对待测DNA模板进行PCR扩增；所述上游引物1的长度为15～30bp。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR的反应体系包括如下终浓度的各组分：0.2～3μmol/L上游引物1、0.2～3μmol/L半随机引物、
0.2mmol/Lxa0dNTP、1×PCRxa0buffer、1.5mM的Mg²⁺、0.02U/μLxa0Taqxa0DNA聚合酶和1～100ng/μL模板；所述PCR的扩增程序为：①92-95℃，3-6min；②94℃，30s；③50-64℃，30s；④72℃，30-180s，其中，步骤②至④的循环数为30-45。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，在PCR完成之后，还需要对PCR的产物进行电泳，选择清晰条带割胶纯化后，进行测序。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述测序用的引物为所述上游引物1或所述半随机引物。本申请是以下申请的分案申请：申请日，2012年7月19日；申请号，201210251634.5；发明创造名称，一种PCR步移技术及其所使用的试剂盒。技术领域
本发明涉及一种PCR步移方法及其所使用的引物和试剂盒，特别涉及一种已知DNA片段侧翼未知序列的PCR步移方法及其所使用的引物和试剂盒，可以广泛应用于遗传及分子生物学领域。
背景技术
到目前为止，绝大多数物种的基因组序列仍然未知，简便易行的基因步移技术在现代分子生物学研究中发挥着不可替代的作用。基因步移技术主要有以下7个方面的应用:(1)分离已知基因的侧翼序列；(2)鉴定基因插入位点；(3)根据基因的已知片段分离、检测目的基因；(4)用于人工染色体片段的构建搭接；(5)构建图位克隆中的重叠群片段；(6)转化标记辅助育种中的STS或SCAR标记等；(7)用于全基因组测序的间隔填补，以获得完整的全基因组序列。基于PCR方法的染色体步移技术按原理可分为两类：一是依赖于酶切连接介导的PCR法，如：反向PCR、载体PCR、接头PCR等，二是不需要酶切连接的PCR法，如：热不对称交错PCR（TAIL-PCR）、半随机引物PCR等。尽管这些方法都有成功应用的实例，但也具有各自的缺点，大部分操作步骤复杂，程序耗时。依赖于酶切连接介导的PCR法需要进行酶切、连接等反应，试剂要求多，操作步骤多，实验耗时，非特异性难以避免。如：反向PCR需先对基因组进行酶切，然后进行连接，需要酶切连接各种试剂，操作步骤多。反向PCR中环化反应难以控制、线状串联体成为副产物甚至是主要产物，导致非特异性扩增。连接PCR和载体PCR等,必须产生一个包括部分已知序列的酶切产物。如果已知序列没有限制酶的酶切位点或是高度重复的，应用就很困难。不需要酶切连接的PCR法，PCR程序设计复杂，且都有低温退火循环步骤，需要多轮PCR，才能获得目标序列，序列特异性难以保证。如：TAIL-PCR设置程序复杂，需要对程序条件进行反复设置，有假阳性。专利《一种长PCR步移试剂盒及其使用方法和应用》中介绍的半随机引物PCR法，操作相对简单、获得序列长度长。但介绍的方法中用到的半随机引物多达11条，工作量大；PCR扩增中途加入试剂，必须通过二轮PCR才能得到目的片段，且PCR程序中有低温退火步骤，PCR污染较难控制，序列扩增特异性难以保证。总之，目前所用的基因步移的方法，均存在操作繁琐、序列扩增特异性差等缺陷。因此，迫切需要探索新的简便、快速、高效的PCR步移技术。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的缺陷与不足，提供一种简便、快速、高效的PCR步移技术。本发明的目的是通过下列技术方案来实现的。本发明采用的技术方案之一是：一用于PCR步移技术的半随机引物，其从5’端至3’端的序列组成依次为：12～30个固定碱基，3～8个全简并的碱基(n)，3～7个固定碱基，n为a、g、c和t中的任一种。较佳地，所述半随机引物的序列如SEQxa0IDxa0NO.3，或者如SEQxa0IDxa0NO.5，或者如SEQxa0IDxa0NO.7所示。本发明采用的技术方案之二是：一种用于PCR步移技术的试剂盒，其包括如上所述的半随机引物。较佳地，所述的试剂盒中还包括dNTP、PCRxa0buffer、Mg²⁺、Taqxa0DNA聚合酶和ddxa0H₂O中的任一种或多种。更佳地，所述的试剂盒还包括基因抽提试剂。本发明采用的技术方案之三是：一种以如上所述的试剂盒进行PCR步移的方法，其包括如下步骤：第一轮PCR，以与待测DNA已知序列相互补的上游引物1和所述的半随机引物对待测DNA模板进行PCR扩增。较佳地，所述上游引物1的长度为15～30bp。本发明中，所述的模板若为真核生物基因组DNA，则在第一轮PCR之后较佳地还包括第二轮PCR：以与待测DNA已知序列相互补的上游引物2和所述的半随机引物为扩增引物，以第一轮PCR的产物为模板进行PCR扩增，所述上游引物2位于上游引物1的5’→3’方向的内侧。本发明中，所述第一轮PCR的PCR反应体系为常规，只要能扩增出目标片段即可。较佳地，所述的PCR反应体系包括如下终浓度的各组分：0.2～3μmol/L上游引物1、0.2～3μmol/L半随机引物、0.2mmol/Lxa0dNTP、1×PCRbuffer、1.5mM的Mg²⁺、0.02U/μLxa0Taqxa0DNA聚合酶和1～100ng/μL模板。本发明中，所述第一轮PCR的PCR扩增程序为常规，只要能扩增出目标片段即可。较佳地，所述的PCR扩增程序为：①92-95℃，3-6min；②94℃，30s；③50-64℃，30s；④72℃，30-180s，其中，步骤②至④的循环数为30-45。本发明中，所述第二轮PCR的PCR反应体系为常规，只要能扩增出目标片段即可。较佳地，所述的PCR反应体系包括如下终浓度的各组分：0.2～3μmol/L上游引物2、0.2～3μmol/L半随机引物、0.2mmol/Lxa0dNTP、1×PCRbuffer、1.5mM的Mg²⁺、0.02U/μLxa0Taqxa0DNA聚合酶和1～50ng/μL模板。本发明中，所述第二轮PCR的PCR扩增程序为常规，只要能扩增出目标片段即可。较佳地，所述的PCR扩增程序为：①92-95℃，3-6min；②94℃，30s；③50-64℃，30s；④72℃，30-180s，其中，步骤②至④的循环数为30-45。本发明中，较佳地，在PCR完成后还需要对第一轮PCR或第二轮PCR的产物进行电泳，选择清晰条带割胶纯化后，进行测序。本发明中，所述电泳较佳地为对PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳；所述测序用的引物对于原核生物而言较佳地为所述上游引物1或所述半随机引物，对于真核生物而言较佳地为所述上游引物2或所述半随机引物。与现有技术相比，本发明所述PCR步移技术具有如下有益效果:本发明所述PCR步移技术同普通二条引物的PCR没有太大区别，最多只需二轮PCR即可获得目标序列，操作简单、快速、高效。本发明通过提高整个PCR循环过程中的退火温度，增加了扩增特异性，且对实验样本没有限制，微生物、动物和植物样品均可使用。本方法用于实验中可以简化操作，缩短实验时间，提高实验效率，降低实验成本，具有十分广阔的应用前景。
附图说明
以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。图1为实施例1第一轮PCR的产物电泳结果图。其中，编号“1”为牛基因第一轮PCR步移结果，“2”为牛基因第二轮PCR步移结果，“M”为DL2,000DNAxa0Marker（Takaraxa0Biotechnology(Dalian)Co.,Ltd.）。图2为实施例1目标序列测序所得的部分序列结果。图3为实施例2PCR产物的电泳结果图。其中，编号“1”为ST-Ⅲ基因的PCR步移结果，“M”为DL2,000DNAxa0Marker（Takaraxa0Biotechnology(Dalian)Co.,Ltd.）。图4为实施例2目标序列测序所得的部分序列结果。图5为实施例3PCR产物的电泳结果图。其中，编号“1”为ST-Ⅲ基因的PCR步移结果，“M”为DL15,000DNAxa0Marker（Takaraxa0Biotechnology(Dalian)Co.,Ltd.。图6为实施例3目标序列测序所得的部分序列结果。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。实施例1xa0xa0牛乳铁蛋白基因PCR步移根据奶牛牛乳铁蛋白基因的5’侧翼区设计上游引物1（P1-1）和上游引物2（P1-2），其序列分别如SEQxa0IDxa0NO.1和SEQxa0IDxa0NO.2所示，本实施例所用半随机引物AP1的序列如SEQxa0IDxa0NO.3所示。利用DNAxa0isolationxa0reagentxa0forxa0meatxa0andxa0meatxa0products（Takaraxa0iotechnology(Dalian)Co.,Ltd.）试剂盒抽提市售牛肉基因组DNA，用P1-1和AP1做第一轮PCR扩增。第一轮PCR扩增的程序为：①92℃，6min；②94℃，30s；③50℃，30s；④72℃，30s，其中，步骤②至④为30个循环。第一轮PCR体系包括如下终浓度的各组分：0.2μmol/L上游引物1、0.2μmol/L半随机引物、0.2mmol/Lxa0dNTP、1×PCRxa0buffer、1.5mM的Mg²⁺、0.02U/μLxa0Taqxa0DNA聚合酶和1ng/μL待测DNA模板。将第一轮PCR扩增产物稀释100倍，取1μL，用P1-2和AP1做第二轮PCR扩增。第二轮PCR扩增的程序为：①92℃，6min；②94℃，30s；③50℃，30s；④72℃，30s，其中，步骤②至④的循环数为30。第二轮PCR扩增的体系包括如下终浓度的各组分：0.2μmol/L上游引物2、0.2μmol/L半随机引物、0.2mmol/Lxa0dNTP、1×PCRxa0buffer、1.5mM的Mg²⁺、0.02U/μLxa0Taqxa0DNA聚合酶和50ng/μL第一轮PCR扩增产物。PCR产物电泳结果表明，所用PCR步移扩增体系和程序下能够扩增出清晰的目标条带。实施例2xa0xa0牛乳铁蛋白基因PCR步移测序根据奶牛牛乳铁蛋白基因的5’侧翼区设计上游引物1（P1-1）和上游引物2（P1-2），其序列分别如SEQxa0IDxa0NO.1和SEQxa0IDxa0NO.2所示，本实施例所用半随机引物AP1的序列如SEQxa0IDxa0NO.3所示。利用DNAxa0isolationxa0reagentxa0forxa0meatxa0andxa0meatxa0products（Takaraxa0iotechnology(Dalian)Co.,Ltd.）试剂盒抽提市售牛肉基因组DNA，用P1-1和AP1做第一轮PCR扩增。第一轮PCR扩增的程序为：①95℃，3min；②94℃，30s；③64℃，30s；④72℃，180s，其中，步骤②至④为45个循环。第一轮PCR体系包括如下终浓度的各组分：3μmol/L上游引物1、3μmol/L半随机引物、0.2mmol/Lxa0dNTP、1×PCRxa0buffer、1.5mM的Mg²⁺、0.02U/μLxa0Taqxa0DNA聚合酶和100ng/μL模板。将第一轮PCR扩增产物稀释200倍，取1μL，用P1-2和AP1做第二轮PCR扩增。第二轮PCR扩增的程序为：①95℃，3min；②94℃，30s；③64℃，30s；④72℃，180s，其中，步骤②至④的循环数为45。第二轮PCR扩增的体系包括如下终浓度的各组分：3μmol/L上游引物2、3μmol/L半随机引物、0.2mmol/Lxa0dNTP、1×PCRxa0buffer、1.5mM的Mg²⁺、0.02U/μLxa0Taqxa0DNA聚合酶和1ng/μL第一轮PCR扩增产物。PCR产物电泳结果见图1，图中编号“1”为牛基因第一轮PCR步移结果，“2”为牛基因第二轮PCR步移结果，“M”为DL2,000DNAxa0Markerxa0（Takaraxa0Biotechnology(Dalian)Co.,Ltd.）。将泳道“2”中的较亮较清晰的条带割胶纯化测序，所测部分序列结果如图2所示。实施例3细菌16sxa0RNA的PCR步移测序根据原核细菌16sxa0RNA序列，设计保守上游引物P2，其序列如SEQxa0IDNO.4所示，本实施例所用半随机引物为AP2，其序列如SEQxa0IDxa0NO.5所示。用TaKaRaxa0minibestxa0bacterialxa0genomicxa0dnaxa0extractionxa0kitxa0ver.2.0（Takaraxa0Biotechnology(Dalian)Co.,Ltd.）细菌基因组抽提试剂盒，抽提植物乳杆菌ST-Ⅲ（Lactobacillusxa0plantarumxa0ST-Ⅲ）（光明乳业股份有限公司提供）菌株基因组DNA，做PCR。PCR程序为：①94℃，5min；②94℃，30s；③52℃，30s；④72℃，120s，其中，步骤②至④为40个循环。PCR体系包括如下终浓度的各组分：0.5μmol/L上游引物、0.5μmol/L半随机引物、0.2mmol/Lxa0dNTP、1×PCRxa0buffer、1.5mM的Mg²⁺、0.02U/μLxa0TaqDNA聚合酶和40ng/μL模板。PCR产物电泳结果见图3，图中编号“1”为ST-Ⅲ基因PCR步移结果，“M”为DL2,000DNAxa0Marker（Takaraxa0Biotechnology(Dalian)Co.,Ltd.）。将泳道1中的较亮较清晰的条带割胶纯化测序，所测序列部分结果如图4所示。实施例4细菌23sxa0RNA的PCR步移测序根据原核细菌23sRNA序列设计保守上游引物P3，其序列如SEQxa0IDNO.6所示，本实施例所用半随机引物为AP3，其序列如SEQxa0IDxa0NO.7所示。用TaKaRaxa0minibestxa0bacterialxa0genomicxa0DNAxa0extractionxa0kitxa0ver.2.0（Takaraxa0Biotechnology(Dalian)Co.,Ltd.）细菌基因组抽提试剂盒，抽提植物乳杆菌ST-Ⅲ（Lactobacillusxa0plantarumxa0ST-Ⅲ，光明乳业股份有限公司）基因组DNA，做PCR。PCR程序为：①94℃，5min；②94℃，30s；③52℃，30s；④72℃，120s，其中，步骤②至④为40个循环。PCR体系包括如下终浓度的各组分：0.5μmol/L上游引物、0.5μmol/L半随机引物、0.2mmol/Lxa0dNTP、1×PCRxa0buffer、1.5mM的Mg²⁺、0.02U/μLxa0Taqxa0DNA聚合酶和80ng/μL模板。PCR产物电泳结果见图5，图中编号“1”为ST-Ⅲ基因PCR步移结果，“M”为DL15,000DNAxa0Marker（Takaraxa0Biotechnology(Dalian)Co.,Ltd.。将泳道1中的较亮较清晰、箭头所示的条带割胶纯化后测序。所测序列部分结果如图6实施例4细菌23sxa0RNA的PCR步移测序所示。ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="485"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="461"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="459"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>